Verschiedene PCR-Typen: Wichtige konzeptionelle MC-Fragen

Inhalte

• Verschiedene Arten von PCR
• Gelöste konzeptionelle MCQs für verschiedene Arten von PCR
• Schlussfolgerungen

Verschiedene Arten von PCR

Polymerasekettenreaktion (PCR) wird aufgrund geringfügiger Modifikationen im Standard-PCR-Verfahren weitgehend klassifiziert. Es gibt verschiedene Arten von PCR:

• Verschachtelte PCR
• Inverse PCR
• Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)
• Asymmetrische PCR
• Quantitative PCR (Q-PCR)
• Quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR oder RTQ-PCR)
• Touchdown-PCR
• Kolonie-PCR
• Allelspezifische PCR
• Polymerase Cycling Assembly (PCA) oder Assembly PCR
• Lineare After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR)
• Dial-Out-PCR
• Helicase-abhängige Amplifikation
• Hot-Start-PCR
• Intersequenzspezifische PCR
• Ligationsvermittelte PCR
• Methylierungsspezifische PCR

Verschachtelte PCR

Diese Technik wird vorgeschlagen, um die Verunreinigungen in amplifizierter DNA aufgrund einer zufälligen Primerbindungsamplifikation zu verringern. Verschachtelte PCR wird mit zwei verschiedenen Primersätzen in zwei aufeinanderfolgenden PCR-Zyklen durchgeführt. Es wird erwartet, dass der nachfolgende Satz das sekundäre Ziel innerhalb des Produkts des primären Laufs verstärkt. Diese Technik ist außerordentlich erfolgreich, erfordert jedoch viel mehr Wissen über die beteiligten Sequenzen. 

Inverse PCR

Es wird durchgeführt, wenn nur eine einzige interne Sequenz der Matrizen-DNA bekannt ist. Diese Technik eignet sich zur Identifizierung der flankierenden Sequenzen zu den verschiedenen Geninserts. Der Prozess umfasst eine Sequenz des Aufschlusses und der Selbstligation der Matrizen-DNA, die zu DNA-Stücken mit bekannten Sequenzen an den Enden einer unbekannten Sequenz führt.

Reverse Transkriptions-PCR (RT-PCR)

Es wird verwendet, um bekannte Sequenzen aus RNA-Bibliotheken zu amplifizieren und zu identifizieren. Die aus der Probe erhaltene RNA wird dann durch die Wirkung der Enzym-Reverse-Enzym-Transkriptase in komplementäre DNA (cDNA) umgewandelt. Danach wurde eine typische PCR durchgeführt. Die RT-PCR wird in großem Umfang zur Identifizierung und Bestimmung der Genexpression verwendet.

Asymmetrische PCR

Es amplifiziert selektiv einen Strang der Matrizen-DNA mehr als den anderen. Es wird bei der Hybridisierungsprüfung verwendet, bei der nur ein Strang als ideal angesehen wird. Eine weitere Amplifikation wird erreicht, indem eine Standard-PCR in Gegenwart von überschüssigen Primern für den ausgewählten Strang durchgeführt wird. 

Quantitative PCR (Q-PCR)

Dies ist das indirekte Verfahren zum Messen der Anfangsmengen von RNA, cDNA oder Matrizen-DNA. Q-PCR wird im Allgemeinen verwendet, um die Menge des PCR-Produkts schnell zu bestimmen. Q-PCR wird auch zum Nachweis spezifischer Sequenzen innerhalb der DNA-Probe verwendet.

Quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR oder RTQ-PCR)

Dieser Prozess verwendet fluoreszierende Farbstoffe, um Echtzeitmengen amplifizierter Produkte zu überwachen und zu messen. Diese quantitative Echtzeit-PCR wird in Konjugation mit QPCR verwendet.

Touchdown-PCR

Diese Technik reduziert die unspezifische Primerbindung durch Verringern der Annealingtemperatur zwischen zwei aufeinanderfolgenden PCR-Zyklen.

Kolonie-PCR

Klone (Bsp. E. coli) werden auf die richtigen Ligationsprodukte analysiert. Eine bestimmte Kolonie wird durch einen sterilen Zahnstocher aufgenommen und in die Mastermischung eingeführt. Die PCR wird mit verlängerter Zeit bei 95 betrieben^oC.

Allelspezifische PCR

Diese Technik basiert auf dem Single Nucleotide Polymorphism (SNPs). Allelspezifische PCR wird häufig für Klonierungs- und Diagnosezwecke verwendet. Einige Vorkenntnisse über die DNA-Sequenz von Allelen und deren Unterschied sind erforderlich. Allelspezifische PCR beinhaltet die Verwendung von Primern SNP, die 3'-Ende enthalten. Eine erfolgreiche allelspezifische PCR-Amplifikation und SNP-spezifische Primer zeigen das Vorhandensein eines bestimmten SNP in der Sequenz an.

Polymerase Cycling Assembly (PCA) oder Assembly PCR

Umfasst die künstliche Produktion der langen DNA-Sequenzen in Gegenwart langer Oligonukleotide und kurzer überlappender Segmente nach dem Standard-PCR-Verfahren. Die langen Oligonukleotide kippen in beide Richtungen (Sense und Antisense), das überlappende Segment bestimmt die Reihenfolge der PCR-Fragmente und erleichtert so die selektive Produktion der endgültigen langen DNA.

Lineare After-The-Exponential-PCR (LATE-PCR)

Bei dieser Technik hat der limitierende Primer (Primer in der geringeren Menge vorhanden) einen höheren Schmelzpunkt als der überschüssige Primer (Primer in ausreichender Menge vorhanden), um die Reaktionseffizienz aufrechtzuerhalten, da die Konzentration des limitierenden Primers in der Mitte der Reaktion abnimmt . 

Dial-Out-PCR

Es ist eine Methode zur Gewinnung von DNA-Molekülen für die Gensynthese. Eine DNA-Bibliothek wird vor der Sequenzierung mit spezifischen flankierenden Tags modifiziert. Später ermöglichen die tag-gerichteten Primer die Gewinnung von DNA gewünschter Sequenzen durch PCR.

Helicase-abhängige Amplifikation

Es ist mit der traditionellen PCR verwandt, verwendet jedoch eine konstante Temperatur anstelle des Zyklus. Anstelle des thermischen Denaturierungsschritts wird DNA-Helikase verwendet. 

Hot-Start-PCR

Diese Technik beseitigte die Möglichkeit einer unspezifischen Amplifikation während der anfänglichen PCR-Zyklen. Die Reaktionsbestandteile werden auf die Denaturierungstemperatur von 95 ° C erhitzt^oC vor der Zugabe von Polymerase. Zur Hemmung werden Inhibitoren und Antikörper in das Reaktionsgemisch eingebracht DNA-Polymerase Aktivität, die bei hohen Temperaturen dissoziiert. 

Intersequenzspezifische PCR

Diese Modifikation der PCR-Technik wird häufig für das DNA-Fingerprinting verwendet, was die Amplifikation von Regionen erfordert, die zwischen den einfachen Sequenzwiederholungen platziert sind, um einen einzigartigen und spezifischen Fingerabdruck / Muster von amplifizierten DNA-Fragmenten zu erzeugen. 

Ligationsvermittelte PCR

Es verwendet spezifisch kleine Linkermoleküle der DNA (die eingefügt werden sollen) und verschiedene Primer, die in der Lage sind, mit der Linker-DNA zu annelieren. Diese Technik wird häufig für die DNA-Sequenzierung und den Fußabdruck verwendet.

Methylierungsspezifische PCR

Diese Technik wird zum Nachweis von CpG-Inseln im Genom verwendet. Bei der methylierungsspezifischen PCR wird die DNA mit Natriumbisulfat behandelt, das die nicht methylierte Cytosinbase in Uracil umwandelt, das von den PCR-Primer-Thyminbasen identifiziert / erkannt wird. Mit Ausnahme der CpG-Inseln der Primer werden zwei verschiedene PCR-Sets an der veränderten DNA unter Verwendung identischer Primer-Sets durchgeführt. Die Primer-Sets erkennen die Cytosin-Basen und andere Primer-Sets erkennen das Uracil, um die nicht methylierte DNA zu amplifizieren. Eine Q-PCR kann auch durchgeführt werden, um die quantitativen Informationen bezüglich der Methylierung zu kennen. 

Konzeptionelle MCQs zu verschiedenen PCR-Typen (gelöst)

Frage 1: Ein Forscher versucht, fünf aufeinanderfolgende Basenpaare in der Mitte eines PCR-amplifizierten DNA-Fragments zu verändern. Welche Technik wird für die Durchführung eines solchen Experiments am meisten empfohlen?

A-DNA-Ligation

B-Assay zur Verschiebung der elektrophoretischen Mobilität (EMSA)

C-PCR-Mutagenese

D- Restriktionsenzym Verdauung

Richtige Antwort: Option C PCR-Mutagenese 

Erläuterung:

Die am meisten empfohlene Technik für solche Modifikationen ist die PCR-Mutagenese. Es kann Primer synthetisieren, die an der gewünschten Stelle der Mutagenese unvollkommen binden. Diese Primer enthalten nun die neue 5-Basenpaar-Sequenz, die in den neuen DNA-Strang eingeführt werden soll. Erstens amplifiziert die PCR das DNA-Fragment, das die Mutantensequenz und die Upstream-Sequenzen enthält. Der zweite PCR-Zyklus amplifiziert den neuen DNA-Strang, der die Mutantensequenz und auch die nachgeschalteten Sequenzen enthält. Und der letzte PCR-Zyklus amplifiziert ein DNA-Fragment aus den beiden Matrizen unter Verwendung der ursprünglichen Primer, um den DNA-Strang voller Länge zu amplifizieren.

Frage 2: Die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet eine hitzestabile Polymerase (Taq-Polymerase) zur Amplifikation des DNA-Strangs. Welche der Aussagen beschreibt am besten, warum thermostabile Polymerasen für die PCR erforderlich sind?

Die A-PCR benötigt einen thermischen Zyklus und die Taq-Polymerasen können inaktiviert werden, da sie während der Niedertemperaturschritte nicht benötigt werden. 

B- Wärmestabile (Taq) Polymerase bricht die dsDNA nur, wenn die Temperatur sehr hoch ist. Daher ist eine hitzestabile (Taq) Polymerase erforderlich.

Die C-PCR erfordert einen thermischen Zyklus, und die hitzestabilen (Taq) Polymerasen denaturieren nicht, um die Wirksamkeit bei der DNA-Polymerisation während der hohen Temperatur zu verlieren (95)^oC) Schritt. 

D- Die Wechselwirkung zwischen zweiwertigen Kationen und DNA-Polymerase ist während Hochtemperaturschritten sehr effizient. Daher erfordert die PCR eine hitzebeständige DNA-Polymerase.

E-Wärmestabile (Taq) Polymerasen sind billiger als Standardpolymerasen; Daher sind sie besser zur Amplifikation von DNA geeignet. 

Richtige Antwort: Option C.

Die PCR erfordert einen thermischen Zyklus, und die hitzestabilen (Taq) Polymerasen denaturieren nicht, um die Wirksamkeit bei der DNA-Polymerisation während der hohen Temperatur zu verlieren (95)^oC) Schritt. Dies macht es einzigartig unter verschiedenen Arten von PCR.

Erläuterung:

Polymerasen denaturieren oft bei höheren Temperaturen. Wenn eine Standard-Polymerase verwendet würde, würde sie während des Hochtemperatur-(Denaturierungs-)Schritts denaturieren, der zum Aufbrechen der doppelsträngigen DNA in einzelsträngige DNA-Matrizen erforderlich ist. Durch die Verwendung dieser hitzestabilen (Taq) Polymerase, die Enzym denaturiert nicht. Die DNA-Stränge werden durch die zu Beginn der PCR hinzugefügte Taq-Polymerase weiter amplifiziert.

Frage 3: Wie ist die richtige Reihenfolge der drei PCR-Schritte?

A- Verlängerung, Denaturierung, Tempern

B- Denaturierung, Glühen, Dehnen 

C-Tempern, Dehnen, Denaturieren

D- Denaturierung, Verlängerung, Glühen

Richtige Antwort: Option B.

Denaturierung, Tempern, Dehnen 

Erläuterung:

Die Schritte der PCR umfassen Denaturierung, Annealing und Extension.

Die Denaturierung erfolgt bei einer Temperatur um 94-98 ° C, um Wasserstoffbrückenbindungen doppelsträngiger DNA aufzubrechen. 

Das Annealing ist der zweite Schritt der PCR, der bei 50-65 ° C abgeschlossen wird. Der Annealing-Schritt muss bei einer niedrigen Temperatur durchgeführt werden, um Primer an den Einzelstrang zu binden, aber hoch genug, um eine unspezifische Hybridisierung zu vermeiden. 

Der Verlängerungs- oder Verlängerungsschritt der PCR ermöglicht es der DNA-Polymerase, die neueste Kopie des Matrizen-DNA-Strangs zu synthetisieren. Die optimale Temperatur hängt von der verwendeten DNA-Polymerase ab, liegt jedoch normalerweise im Bereich von 75 bis 80 ° C.

Frage 4: Welches der folgenden Elemente ist / sind kein Bestandteil eines Polymerasekettenreaktionsgemisches?

A- Pufferlösung

B-DNA-Polymerase

C-Formamid

D-DNA-Matrizenstrang

Richtige Antwort: Option C.

Formamid

Erläuterung:

Die Bestandteile der PCR sind DNA (Taq) -Polymerase, Puffer, Primer, Magnesiumchlorid, dNTPs (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin), Desoxynukleotidtriphosphate und der DNA-Matrizenstrang.

Schlussfolgerungen

In diesem Artikel haben wir verschiedene Arten von PCR diskutiert. Weitere Informationen zu diesem Thema finden Sie unter verschiedene Arten von PCR.

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