Polymerase-Kettenreaktion: 9 wichtige Erklärungen

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Was ist Polymerasekettenreaktion?

Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein weiteres weit verbreitetes Molekularbiologie Technik zur enzymatischen Herstellung von DNA ohne Verwendung von Zellmaschinerie, beispielsweise Hefe oder E. coli. Das Verfahren erlaubt eine begrenzte Menge der DNA sein verstärkt mehrere Falten dramatisch. PCR wird regelmäßig in verwendet klinisch, gerichtlichund biologische Labore für verschiedene Zwecke, wie zum Beispiel das Bestimmen genetische Fingerabdrücke, Krankheitsdiagnose, Klonen von Genen, und Vaterschaftstest. 

Diese Technik wurde 1983 von Kary Mullis entwickelt. Die PCR ist derzeit ein entscheidendes und bedeutendes Verfahren in der angewandten Biologie. Diese enthalten DNA-Klonierung zur Sequenzierung, DNA-basierten Phylogenie oder aktiven Untersuchung der Genexpression und zur Bestimmung genetisch übertragener Krankheiten. 1993 wurde Mullis für seine Arbeiten zur PCR mit dem Nobelpreis für Chemie ausgezeichnet. 

Die PCR wird im Allgemeinen in einem Reaktionsgemisch mit einem Gesamtvolumen von 0.1 bis 0.2 ml in Reaktionsröhrchen (0.2 bis 0.5 ml Volumen) in einem Instrument durchgeführt, das als bekannt ist ein Thermocycler. Ein Thermocycler erwärmt und kühlt die DNA ab, um die in jedem Reaktionsschritt erforderlichen Temperaturen zu erreichen. Die dünnwandigen Reaktionsrohre bieten die gewünschte Wärmeleitfähigkeit und ermöglichen einen schnelleren Wärmeausgleich. Normalerweise haben die Thermocycler beheizte Oberseiten oder Deckel, die die Kondensation von Reaktionskomponenten am oberen Ende des Rohrs verhindern. 

Anforderungen an die Polymerasekettenreaktion

• DNA zu amplifizierendes Fragment (Matrizen-DNA oder cDNA)
• Primer (Vorwärtsprimer und Rückwärtsprimer), die Enden der Matrizen-DNA erkennen können. Primer sind üblicherweise 18-25 Basenpaare lang.
• Thermostabil DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) katalysiert die DNA-Synthese. Taq-Polymerase wird erhalten aus Thermus Aquaticus.
• Nucleotides
• Puffer (liefert ein optimales Medium für die Aktivität der thermostabilen DNA-Polymerase)

Funktionsprinzip der Polymerasekettenreaktion

Die PCR wird als Kettenreaktion bezeichnet, da die neu synthetisierten Stränge als Matrize für die weitere Synthese der DNA in den nachfolgenden Zyklen dienen. 

Die PCR besteht aus 3 aufeinanderfolgenden Reaktionen:

• Denaturierung von DNA: Der Prozess der Denaturierung trennt die Stränge doppelsträngiger DNA. Für die menschliche DNA, die Denaturierungstemperatur liegt bei etwa 93-95oC. Die Denaturierung von DNA erfolgt durch Aufbrechen der Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den beiden Polynukleotidsträngen der DNA. Der Denaturierungsprozess wird oft für 5 Minuten oder längere Zeit durchgeführt, um sicherzustellen, dass beide Stränge der Matrizen-DNA vollständig voneinander getrennt sind. Der Denaturierungsprozess aktiviert auch thermostabile DNA-Polymerase.
• Grundglühen: Nach der Denaturierung werden Vorwärts- und Rückwärtsprimer in das Reaktionsgemisch eingeführt. Die Lösung wird dann für das Primer-Tempern abgekühlt. Normalerweise erfolgt das Primer-Annealing zwischen 50 und 70^oC abhängig von der Tm (Schmelztemperatur) der DNA. Idealerweise beträgt die Glühtemperatur 5^oC unterhalb der Tm. Die Annealingtemperatur sollte niedrig sein, um ein Hybrid zwischen dem Primer und der Matrizen-DNA zu bilden, und hoch genug, um nicht übereinstimmende Hybride zu verhindern. Die Tm der DNA hängt ausschließlich vom GC- und AT-Gehalt der DNA ab. Der Primer-Annealing-Schritt dauert normalerweise 1-2 Minuten. Tm kann experimentell bestimmt oder theoretisch nach der folgenden Formel berechnet werden:

Tm = [4 x (G + C)] + [2 x (A + T)]^oC

• DNA-Synthese: Die thermostabile DNA-Polymerase (Taq-Polymerase) bindet in der Nähe der RNA-Bindungsregion und enthält die freien Nukleotide um einen neuen DNA-Strang neben dem Matrizenstrang zu verlängern und zu synthetisieren. Die optimale Temperatur des Verlängerungsschrittes hängt von der Art der verwendeten Polymerase ab; für Taq-Polymerase liegt die optimale Temperatur bei etwa 72°C^oDie Dauer dieses Verlängerungsschritts hängt von der Länge der Matrizen-DNA und der Effizienz der thermostabilen DNA-Polymerase ab; Normalerweise sind es ein Kilobasenpaar pro Minute.

Alle oben genannten Reaktionen werden 30 Mal wiederholt, um ungefähr 1 Milliarde Kopien der Matrizen-DNA zu erhalten.

Stadien der Polymerasekettenreaktion

Der PCR-Prozess ist in drei Phasen unterteilt:

• Exponentielle Verstärkung: Die DNA-Polymerase erfüllt die optimale Funktion, und nach Abschluss jedes Zyklus wird die Produktmenge verdoppelt. Zu Beginn der Reaktion muss nur eine geringe Menge der DNA vorhanden sein, da die Reaktion sehr empfindlich ist.
• Nivellierungsphase: Die DNA-Polymerase zeigt aufgrund der geringeren Verfügbarkeit der Reagenzien wie Nukleotide eine geringere Aktivität.
• Tablett: Durch Erschöpfung des Reagenzes wird kein Produkt mehr gebildet.

Verwendung der Polymerasekettenreaktion

Die PCR kann verwendet werden, um zahlreiche genomgebundene Anomalien, eine breite Palette von Analysen und Experimenten zu identifizieren. Einige Beispiele für die Verwendung von PCR werden nachstehend erörtert:

• Identifizierung von Infektionserregern wie CMV, Mycoplasma, Pneumonie, ansteckenden und Protozoen-bezogenen Krankheiten, Hepatitis usw. in der Probe.
• Bestimmung der Malignität, insbesondere bei Lymphomen und Leukämien. 
• Vaterschaftstests und genetischer Fingerabdruck. 

Die PCR ermöglicht die Früherkennung von Anomalien, die derzeit in der Krebsforschung am weitesten entwickelt sind. PCR-Messungen können direkt an den genomischen DNA-Proben durchgeführt werden, um translokationsspezifische maligne Zellen mit einer mehr als 10,000-fachen Empfindlichkeit im Vergleich zu jeder anderen Methode zu erkennen. 

Die PCR identifiziert auch nicht kultivierbare und langsam wachsende Mikroorganismen wie Mykobakterien, anaerobe Mikroorganismen und Viren aus Gewebekulturtechniken und tierbasierten Modellen. PCR-demonstrative Anwendungen in der Mikrobiologie sind die Erkennung von Krankheitserregern und die Fähigkeit dazu zwischen nicht pathogenen und pathogenen Stämmen unterscheiden durch Identifizierung der spezifischen Gene. 

Die PCR wird verwendet, um ein kurzes Stück eines DNA-Strangs zu intensivieren. Dieser DNA-Strang kann ein vollständiges Gen oder nur ein Teil eines Gens sein. Im Gegensatz zu lebenden Systemen kann der PCR-Zyklus nur kurze DNA-Fragmente amplifizieren bis zu 10 Kilobasenpaare. Verschiedene andere Techniken können DNA-Fragmente mit einer Größe von bis zu 40 kb amplifizieren, was immer noch weniger als die Größe von ist chromosomale DNA eines Eukaryoten Zelle – zum Beispiel enthält eine menschliche Zelle ungefähr drei Milliarden Nukleotidbasenpaare. 

Väterliche Prüfung kann unter Verwendung von PCR durchgeführt werden, indem die DNA der Personen entnommen wird, die den Streit haben. Die DNA der Testpersonen wird amplifiziert und durchverdaut Restriktionsenzyme und mit Gelelektrophorese analysiert. Das Muster der DNA-Fragmente auf dem Agrosegel ist als DNA-Fingerabdruck des Individuums bekannt. Eng oder blutsverwandte Personen haben eine ähnliche DNA-Fingerabdruck-Methode Muster im Vergleich zu den entfernt verwandten oder nicht verwandten Individuen. Die erhaltenen Fingerabdrücke können für Eltern-Kind oder Geschwister mit zwei oder mehr genetischen (DNA) Fingerabdrücken weiter analysiert werden. Das Erhaltene DNA-Fingerabdrücke können verwendet werden, um dies zu wissen die evolutionären Beziehungen zwischen den Organismen. 

Seine Größe kann das Endprodukt der PCR leicht erkennen Agarose-Gelelektrophorese. Die Agarosegelelektrophorese wird durchgeführt, indem die DNA-Proben in das Agarosegel injiziert werden. Der elektrische Strom wird durch das Agarosegel geleitet, um die Mobilität der DNA-Proben zu ermitteln. Kleinere DNA-Fragmente bewegen sich im Gel schneller und umgekehrt. Das PCR-Produkt und das Proben-DNA-Fragment werden durch Einführen einer DNA-Leiter in das Agarosegel identifiziert. Die DNA-Leiter enthält DNA-Moleküle bekannter Größe. 

Bisher war die Identifizierung der genetischen Störung durch Beobachtung des Genoms eine schwierige Aufgabe. Später, durch die Entwicklung der PCR, wird dieser Prozess verkürzt. Jedes interessierende Gen kann leicht unter Verwendung geeigneter Primer amplifiziert und dann sequenziert werden, um Mutationen in der DNA nachzuweisen. Die frühzeitige Identifizierung einiger tödlicher Virusinfektionen kann auch durch PCR erfolgen. 

Arten der Polymerasekettenreaktion

Basierend auf einigen geeigneten Modifikationen in der Technik, Polymerase-Kettenreaktion wird in folgende Typen eingeteilt:

• Verschachtelte PCR
• Inverse PCR
• Reverse Transkription (RT-PCR)
• Asymmetrische PCR
• Quantitativ (PCR-Q-PCR)
• Quantitative Echtzeit-PCR (QRT-PCR)
• Touchdown-PCR
• Kolonie-PCR
• Allelspezifische PCR
• Assemblierungs-PCR oder Polymerase-Cycling-Assemblierung (PCA)
• Asymmetrische PCR
• Linear nach der Exponential-PCR (LATE-PCR)
• Dial-out-PCR
• Helicase-abhängige Amplifikation
• Heißstart-PCR
• Intersequenzspezifische PCR
• Inverse PCR
• Ligationsvermittelte PCR
• Methylierungsspezifische PCR
• Mini-Primer-PCR

Vorteile der Polymerasekettenreaktion

• Die Polymerasekettenreaktion kann zur Identifizierung einer Vielzahl genetischer Anomalien verwendet werden.
• Die PCR wird in einer Vielzahl von Laborexperimenten und -verfahren in der Molekularbiologie eingesetzt.
• Die PCR kann maligne Erkrankungen wie Leukämie, Lymphom usw. und verschiedene andere Erkrankungen wie Toxoplasma gondi, Staphylokokken-Bakteriämie, Malariainfektionen usw. nachweisen.
• Bei genetischen Fingerabdrücken und Vaterschaftstests ist die PCR der entscheidende Schritt.
• Die hohe Empfindlichkeit und Spezifität der PCR macht sie zu einem wichtigen Werkzeug für Experimente auf der Basis von Biotechnologie und Molekularbiologie.

Nachteile der Polymerasekettenreaktion

• Die Polymerasekettenreaktion erfordert einen Thermocycler, eine elektrophoretische DNA-Anordnung, ein DNA-Isolierungskit und andere kostspielige Chemikalien, die das Verfahren teuer machen.
• Erfordert geschulte, qualifizierte und erfahrene Techniker für die Durchführung von Experimenten.
• Grundlegende Sicherheitslabors mit Luftentfeuchtern und Laminar-Flow-Einrichtungen sind erforderlich.
• Es ist schwer, sich PCR-basierte Tests für die reguläre Öffentlichkeit zu leisten.
• Nicht alle Krankheiten konnten durch PCR identifiziert und diagnostiziert werden.
• Möglichkeit, falsch positive und falsch negative Ergebnisse zu erhalten.

Die Polymerasekettenreaktion ist eine allgemein verwendete und allgemein akzeptierte Technik zur Identifizierung mehrerer tödlicher Infektionserreger mit Empfindlichkeit und Spezifität. Die PCR wird in verschiedenen fortschrittlichen medizinischen Zentren, modernen Labors und medizinischen Instituten als Routine-Diagnose- und Forschungsmodul eingesetzt. Die Polymerasekettenreaktion spielt eine entscheidende Rolle bei der Identifizierung von Anomalien, die atypische klinische Symptome darstellen. Die PCR ermöglicht die Früherkennung dieser Arten von Beeinträchtigungen. Früherkennung kann dazu beitragen, den Einzelnen viel besser zu verwalten, was die soziale und wirtschaftliche Belastung der Familie des Probanden verringern kann.

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Concept Checker MCQs

Frage Nr. 1: Ein Student führt eine PCR durch, um eine Probe der Matrizen-DNA zu amplifizieren. Er vergaß jedoch, dem Experiment einen DNA-Primer hinzuzufügen. Welche der folgenden Optionen bietet das bestmögliche Ergebnis?

A- Die Reaktion findet nicht statt.

Die B-Reaktion funktioniert, aber der Prozess amplifiziert unspezifische Regionen (nicht den gewünschten DNA-Anteil der DNA.

Die C-Reaktion funktioniert jedoch mit einer längeren Geschwindigkeit

D-Reaktion funktioniert und das Produkt zeigt unerwünschte Mutationen.

Option A: "Die Reaktion wird nicht stattfinden" ist die richtige Antwort.

Erläuterung: Primer sind für das Funktionieren der PCR unerlässlich. Die Taq-Polymerase benötigt sie, um die Bindung (im Annealing-Schritt) zu initiieren DNA Replikation. Somit funktioniert die PCR in Abwesenheit von Primern nicht und es findet keine Amplifikation statt.

Frage Nr. 2: Ein Student / Forscher möchte das menschliche Hämoglobin-Gen in einen Expressionsvektor einfügen, um das Gen in Mauszellen zu klonieren und zu exprimieren, um den resultierenden Phänotyp zu analysieren. Welche der folgenden Abfolgen von Verfahren ermöglicht es dem Studenten / Forscher, das Gen erfolgreich zu klonieren?

Option A:

1. Amplifizieren Sie das Gen durch PCR

2. Verwenden Sie ein Restriktionsenzym zum Schneiden des Expressionsvektors

3. Ligieren Sie das Gen und den verdauten Vektor

Option B: 

1. Ligatgen

2. Verwenden Sie ein Restriktionsenzym zum Schneiden des Expressionsvektors 

3. Amplifizieren Sie das Gen und den verdauten Expressionsvektor mittels PCR

Option C:

1. Verwenden Sie ein Restriktionsenzym zum Schneiden des Expressionsvektors

2. Amplifizieren Sie das Gen durch PCR

3. Ligieren Sie das Gen und den verdauten Vektor

Variante D:

1. Verwenden Sie ein Restriktionsenzym zum Schneiden des Expressionsvektors

2. Ligieren Sie das Gen und den verdauten Vektor

3. Amplifizieren Sie das Gen mittels PCR

Option A: Ist der und beseitigen Muskelschwäche zu erhalten 

1. Amplifizieren Sie das Gen durch PCR

2. Verwenden Sie ein Restriktionsenzym zum Schneiden des Expressionsvektors

3. Ligieren Sie das Gen und den verdauten Vektor

Erklärung: Zunächst werden wir PCR verwenden, um das interessierende Gen aus dem menschlichen Genom mit Restriktionsstellen an den Enden zu amplifizieren (dies hilft bei seiner Ligation an eine Restriktion Enzym verdaut Vektor). Später muss der Expressionsvektor unter Verwendung desselben Restriktionsenzyms verdaut werden, und dann wurden der verdaute Vektor und das amplifizierte Gen miteinander ligiert. Das Endprodukt wird aus zwei Segmenten bestehen: dem ursprünglichen Vektor und dem interessierenden Gen.

Frage Nr. 3: Mit welchem ​​Instrument wird die DNA-Amplifikation durch PCR abgeschlossen?

A- Genetischer Analysator

B-UV-Spektrophotometer

C-Thermocycler

D-Zentrifuge

Option C: Thermocycler ist die richtige Antwort

Erläuterung: Der Thermocycler kann so eingestellt werden, dass er einen Zyklus der Denaturierungs-, Glüh- und Verlängerungsstufen in einer kleinen Menge des Reaktionsvolumens durchführt. Ein Thermocycler wird verwendet, um eine PCR-Amplifikation durchzuführen.

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Dr. Abdullah Arsalan

Ich bin Abdullah Arsalan und habe meinen Doktortitel in Biotechnologie abgeschlossen. Ich verfüge über 7 Jahre Forschungserfahrung. Ich habe bisher 6 Artikel in international renommierten Fachzeitschriften mit einem durchschnittlichen Impact-Faktor von 4.5 veröffentlicht und einige weitere kommen in Betracht. Ich habe Forschungsarbeiten auf verschiedenen nationalen und internationalen Konferenzen präsentiert. Mein Interessengebiet ist Biotechnologie und Biochemie mit besonderem Schwerpunkt auf Proteinchemie, Enzymologie, Immunologie, biophysikalischen Techniken und Molekularbiologie.