Reverse-Transkriptase-Mechanismus: 9 wichtige Fakten

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Transkription

Die Transkription ist der Anfang in Richtung "Genexpression".

In diesem Prozess werden die im „aus vier Buchstaben bestehenden genetischen Code der DNA“ enthaltenen Informationen in den aus drei Buchstaben bestehenden genetischen Code der RNA übertragen. “

können wir die Transkription erklären, wenn sie eine Kopie von RNA aus DNA erstellt oder die genetische Information von DNA auf RNA übertragen wird.

Der Transkriptionsprozess beinhaltet ein Enzym, das als RNA-Polymerase bekannt ist; Dieses Enzym verwendet DNA als Matrize und erleichtert die Verknüpfung von Nukleotiden zur Bildung von RNA (entsprechend und komplementär zur Matrizen-DNA-Sequenz).

Der Transkriptionsprozess wird in drei Schritten abgeschlossen.

Stufe 1: Einweihung

Stufe 2: Dehnung

Stufe 3: Kündigung

Eukaryotische Transkriptionjpg
Abbildung: Drei grundlegende Transkriptionsschritte (Prozess der Übertragung genetischer Informationen von DNA auf RNA); Initiierung, Verlängerung und Beendigung https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Eukaryotic_Transcription.png

Bei Eukaryoten sind einige Stadien bekannt, da auch posttranslationale Modifikationen auftreten, bei denen die RNA Modifikationen erfährt, wie z.

Spleißen

5'-Capping

Poly A Schwanz Einbau

Wichtiger Hinweis: Die Transkription erfolgt für jedes einzelne in unserem Genom vorhandene Gen separat.

DNA hat enorme Gene, jedes Gen kodiert für ein Gen. Die Transkription kopiert die Informationen des Protein-kodierenden Gens in ein RNA-Transkript.

Transkriptase

Transkriptasen sind die Enzyme, die die RNA-Synthese aus der Matrizen-DNA katalysieren. Dieser Vorgang wird als Transkription bezeichnet. Reverse Transkriptasen (RTs) sind die Enzyme, die die Bildung von cDNA (komplementäre DNA) aus der RNA-Matrize katalysieren. Dieser Vorgang wird als reverse Transkription bezeichnet.

Reverse Transkription

Bei der reversen Transkription DNA wird synthetisiert aus einer RNA-Matrize (Gegenteil des Transkriptionsprozesses, bei dem RNA aus der DNA-Matrize synthetisiert wird). Die bei der reversen Transkription produzierte DNA wird als komplementäre DNA (cDNA) bezeichnet. Reverse Transkription wird durch ein Enzym durchgeführt, das als Reverse Transkriptase bekannt ist. 

Anforderungen an die reverse Transkriptase:

           RNA-Matrize

           Kurzer Primer (zur Bindung an das 3'-Ende der RNA)

Der kurze Primer bindet an die komplementäre Region am 3'-Ende und startet die Synthese der komplementären DNA. Diese cDNA wird in der PCR (Polymerase-Kettenreaktion) als Matrizen-DNA verwendet. cDNA wird dann durch DNA-Polymerase- und DNA-Ligase-Wirkung in doppelsträngige DNA umgewandelt. Diese Kombination von PCR und RT-PCR (eine Kombination aus Polymerasekettenreaktion und reverser Transkription) ermöglicht den Nachweis winziger Mengen von in der Probe vorhandenen RNAs. Beim Klonen wird häufig die reverse Transkription verwendet, um die Kopienzahl zu erhöhen. 

Reverse Transkription
Abbildung: Umgekehrtes Transkriptionsschema, die RT bindet an die ssRNA und steuert die Synthese von cDNA, die später in dsDNA umgewandelt wird. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcription_polymerase_chain_reaction.jpg

Oft werden mehrere konstruierte RTs verwendet, um die Effizienz der Produktbildung zu erhöhen. Die konstruierte RT stellt das vollständige Kopieren des 5'-Endes der mRNA sicher. Thermostabile RTs sind auch für den Einsatz bei höheren Temperaturen ausgelegt.

Welche reverse Transkriptase synthetisiert?

Die reverse Transkriptase erleichtert die Synthese von DNA aus dem viralen RNA-Genom. Diese neu gebildete DNA ist als komplementäre DNA (cDNA) bekannt. RT ist hauptsächlich in Viren vorhanden, die RNA-Genom enthalten. Das virushaltige RNA-Genom ist als Retrovirus bekannt.

Was ist die Funktion der reversen Transkriptase?

Reverse Transkriptase ist eine RNA-abhängige DNA-Polymerase (sie benötigt RNA als Matrize, um cDNA zu synthetisieren). Die RT identifiziert und bindet die RNA, um Single Stand RNA (ssRNA) zu synthetisieren. Nach der Synthese der cDNA spaltet RT die RNA und beginnt mit der Synthese doppelsträngiger DNA (dsDNA).   

Reverse Transkriptase hat zwei aktive Stellen (aktive Stellen), um zwei getrennte Funktionen auszuführen:

Aktives Polymerase-Zentrum: Es umfasst zwei fingerähnliche Domänen; Eine Domäne kann die RNA identifizieren und unter Verwendung von Seitenketten Wasserstoffbrücken mit Phosphatgruppen bilden.

Die Bildung von Wasserstoffbrücken bewirkt Konformationsänderungen und erleichtert das Schließen des Erkennungslochs. Dies führt zum Start des Transkriptionsprozesses (durch Zugabe von Nukleotiden) mit Hilfe der Magnesiumionen der zweiten Domäne.

Die flexible Zone regelt den Konformationsänderungsprozess. Diese flexible Zone befindet sich zwischen den Domänen des aktiven Zentrums der Polymerase. Es wird oft als Zielstelle angesehen, um die RT-Aktivität während biochemischer und pharmakologischer Studien zu hemmen. Die in der flexiblen Zone vorhandene Aminosäuresequenz ist nicht konserviert (ändert sich im Verlauf der Evolution stark), wodurch das Virus Resistenzen entwickeln kann.

Ribonuklease-H-Domäne: Sie ist für die Spaltung der RNA- und ssDNA-Freisetzung verantwortlich. Magnesiumionen helfen der Ribonuklease-H-Domäne bei der Erkennung von Phosphatgruppen. Die zweite Kette der Ribonuklease-H-Domäne weist keine enzymatische Aktivität auf. Es interagiert nur und stabilisiert das aktive Zentrum.

Der genaue katalytische Mechanismus der RT wird noch erforscht. Das oben erwähnte Schema ist die Grundidee der von RT durchgeführten Katalyse.

Im Gegensatz zur DNA-Polymerase fehlt RT aufgrund des Fehlens eines Klenow-Fragments die Korrekturleseaktivität. Das Fehlen einer Korrekturleseaktivität führt zu mehr Fehlern im Transkript, was zu enormen Möglichkeiten für Mutationen des Virus führt.

Reverse Transkriptase des Retrovirus

Die Viruspartikel aller Retroviren enthalten ein multifunktionales Enzym, das als RT bekannt ist. Diese RT ist erforderlich, um die DNA-Kopie des RNA-Genoms eines Retrovirus zu synthetisieren, sobald es in eine Wirtszelle eintritt. 

Die Bestimmung der 3D-Struktur der reversen Transkriptase ergab die Wechselwirkungen zwischen den beiden aktiven Zentren, einschließlich Bindung und Katalyse. Das strukturelle Wissen des Enzyms bietet uns die Möglichkeit, neuartige antivirale Medikamente zur Behandlung von Retroviren zu untersuchen.

Reverse HIV-Transkriptase

Das Humane Immunschwächevirus (HIV) ist für die Verbreitung des erworbenen Immunschwäche-Syndroms (AIDS) verantwortlich. HIV kodiert hauptsächlich für vier Typen von Proteinuntereinheiten, die DNA-Polymerase-, RNase-H-, Integrase- und Protease-ähnliche Aktivität aufweisen. DNA-Polymerase- und RNase-H-Aktivität werden von einer einzelnen Untereinheit der reversen Transkriptase von HIV (heterodimeres Enzym) besessen.

Um die genomische RNA des Virus in die dsDNA in einer Wirtszelle umzuwandeln, zeigt die reverse Transkriptase von HIV sowohl RNase H- als auch DNA-Polymeraseaktivität. Die Forschung wird weiter untersucht, wie die reverse Transkriptase von HIV ihre Untereinheit (Ribonuclease H-Domäne) einsetzt, um das Genom (RNA) des Retrovirus zu hydrolysieren. Die Stellen und die Konformation der reversen Transkriptase für die DNA-Synthese und die RNA-Hydrolyse sind unterschiedlich. Diese Unterscheidung in der Konformation und Offenbarung des strukturellen Hohlraums macht ihn zu einem potenziellen Zielkandidaten für die Hemmung der reversen Transkriptase.

HIVRT
Abbildung: Struktur der reversen HIV-Transkriptase während der Synthese von cDNA. Normalerweise hat die HIV-RT zwei aktive Stellen. Eine katalytische Stelle hat eine Polymerasefunktion, während die andere eine Nukleaseaktivität aufweist. https://commons.wikimedia.org/wiki/File:Reverse_transcriptase_3KLF_labels.png

Wichtiger Hinweis: Die RNase H-Aktivität der reversen HIV-Transkriptase hängt vollständig von der Aminosäuresequenz des aktiven Zentrums ab. Der eigentliche Mechanismus muss noch entdeckt werden.

Schlussfolgerungen

In diesem Artikel wurden die Ereignisse der Transkription, der reversen Transkription und die Bedeutung der reversen Transkriptase bei Retroviren diskutiert. Weitere Informationen zu verwandten Themen finden Sie unter Klicken Sie hier.

FAQs

Q1 Welche Rolle spielt die reverse Transkriptase?

Beantworte die Enzym RT wird auch als RNA bezeichnet abhängige DNA-Polymerase; es katalysiert die Transkription retroviraler genomischer RNA in cDNA.

F2 Woher kommt die reverse Transkriptase?

Antworten: Der Prozess der reversen Transkription findet in Retroviren, Prokaryoten und bis zu einem gewissen Grad sogar in Eukaryoten statt. Es ist an der Synthese von cDNA aus RNA beteiligt. Retroviren haben RTs, die von RNA abhängig sind, um cDNA zu synthetisieren. Die nukleare Teilung beinhaltet nicht die Verwendung von RT. Ein Das als Telomerase bekannte Enzym ist in Eukaryoten vorhanden. Telomerase ist eine spezialisierte RT, die Telomer-DNA (vorhanden an den Chromosomenspitzen) aus RNA synthetisiert.

Q3 Welche Organismen haben eine reverse Transkriptase?

Beantworte die Enzym RT ist in vielen Organismen wie Pflanzen vorhanden, Tiere, Bakterien und Viren. Die Rolle des Enzyms RT besteht darin, eine RNA-Sequenz in eine cDNA-Sequenz umzuwandeln. Es ist allgemein in allen Organismen. Zu den spezifischen Funktionen von RT gehören:

Retrovirus-Vermehrung

Vielfalt eukaryotischer mobiler Transposons oder Retrotransposons

Replikation oder Synthese von Telomeren

Synthese von einzelsträngiger Mehrfachkopie-DNA (msDNA), extrachromosomaler DNA / RNA und chimären Elementen.

F4 Machen Menschen eine reverse Transkriptase?

Antworten: Ja, Menschen exprimieren reverse Transkriptasen. Telomerase ist ein Typ der reversen Transkriptase. Es kommt in vielen Eukaryoten vor. Menschen tragen eine RNA-Matrize der Telomerase, um telomere DNA zu bilden.

F5 Wie verhindern Sie die reverse Transkriptase?

Antworten: Reverse Transkriptaseaktivität kann durch Verwendung starker Enzyminhibitoren verhindert werden. Diese Inhibitoren (speziell für RTs) sind im Allgemeinen antiretrovirale Mittel. Inhibitoren beschränken die RT durch Bildung von cDNA aus viraler RNA und stoppen daher die Vermehrung des Virus.

F6 Was ist der Unterschied zwischen Echtzeit-PCR und reverser Transkriptase?

Antworten: Die reverse Transkriptase-PCR (RT-PCR) ist viel empfindlicher als die reguläre PCR. RT-PCR wird häufig verwendet, um die Expression eines bestimmten Gens, die DNA-Sequenzierung, die DNA-Klonierung, die Überwachung von Erbkrankheiten und die Analyse funktioneller Gene nachzuweisen. Im Gegensatz dazu wird die allgemeine PCR häufig für DNA-Amplifikationszwecke verwendet.

F7 Warum wird RNA in cDNA umgewandelt?

Antworten: Reverse Transkriptase transkribiert normalerweise Template-RNA in cDNA. 

cDNA wird im Allgemeinen in der Molekularbiologie zum Klonieren verwendet eukaryotische Gene in die prokaryotische Zelle Fabriken. Wann immer wir ein Protein (von externer Quelle) in eine Zelle exprimieren wollen, die normalerweise kein solches Protein synthetisiert, benötigen wir eine cDNA-Transformation in die prokaryotische Zellfabrik.

F8 Was ist der Unterschied zwischen QPCR und RT-PCR?

Antworten: Beide Techniken sind miteinander verbunden und werden zur Herstellung / Amplifikation von DNA-Kopien verwendet. RT-PCR amplifiziert die reverse Transkription des RNA-Codes, während Q-PCR den Amplifikationsprozess misst. Die Q-PCR dient zur Quantifizierung, während die RT-PCR zur Amplifikation dient. Q-PCR ist quantitativ, während RT-PCR nicht quantitativer Natur ist.

F9 Kann die Transkriptase umkehren und DNA als Matrize verwenden.

Antworten: Reverse Transkriptase verwendet einzelsträngige RNA als Matrize zur Synthese doppelsträngiger DNA-Kopien. RTs verwenden keine DNA als Vorlage.

F10 Was zeichnet die reverse Transkriptase aus?

Antworten: Das charakteristische Merkmal der reversen Transkriptase ist die Übertragung der genetischen Information von RNA auf DNA. 

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